一、基于双链特异性核酸酶（DSN）的microRNA检测平台

MicroRNA是由内源基因编码的单链RNA分子，在生物体内参与转录后的基因表达与调控。它是一类重要的生物标志物，可应用于恶性肿瘤的早期诊断。双链特异性核酸酶（DSN）可选择性切割DNA-RNA结构中的DNA探针，使RNA释放出来，从而实现目标RNA的循环利用，放大其检测信号。据此，王颇老师课题组与苗向敏老师合作，建立了一种microRNA-155的免标记检测方法，并将其应用于血清样品中miRNA-155的定量检测。此方法具有较高的灵敏度和良好的选择性，常见的金属离子、蛋白质分子和其它RNA序列对检测体系无显著性影响，相关研究结果发表于Anal. Chem., 2018, 90, 1098−1103（TOP-SCI，一区）。

图1. 基于双链特异性核酸酶的RNA检测原理示意图

二、基于原位DNA模板合成的Pd纳米粒子的电化学免疫分析

本工作以原位DNA模板合成的Pd纳米粒子为信号标记，基于邻近杂交调控的发夹式DNA自组装，构建了一种新颖的电化学免疫分析方法。基于DNA模板合成的Pd纳米粒子对NaBH₄的氧化具有较高的催化效率，可产生较强的检测信号。根据免疫分析的基本原理，该方法可实现微量组分癌胚抗原（CEA）的电化学检测。通过引入超级三明治（Supersandwich）反应体系增加DNA链长，可进一步放大检测信号。由于抗原与抗体的特异性识别，该方法呈现出良好的选择性，可应用于血清样品中CEA检测。因此，基于DNA模板合成的Pd纳米粒子信号放大策略在临床应用领域具有现实性意义，此项研究结果发表于Anal. Chim. Acta, 2017, 969, 8–17（TOP-SCI，二区）。

图2. 基于原位DNA模板合成的Pd纳米粒子的电化学免疫分析原理示意图

三、甲基化胞嘧啶在石墨烯纳米墙界面上的信号识别和检测

本工作以聚吡咯功能化的石墨烯纳米墙界面构建为基础，考察了胞嘧啶（C）和5-甲基胞嘧啶（mC）的直接电位分辨和同时测定，并实现了寡核苷酸甲基化水平的电化学评估。借助于吡咯单体和十二烷基硫酸钠，可以将石墨烯定向组装到碳基电极表面，形成有序的纳米墙结构。石墨烯纳米墙对嘌呤和嘧啶碱基均呈现出良好的催化活性，可应用于五种DNA碱基的信号识别和定量检测，据此实现了寡核苷酸序列中mC和C的直接电化学检测，研究结果发表于Electrochem. Commun., 2015, 61, 36–39（TOP-SCI，一区）。

图3. 石墨烯纳米墙的界面表征及其对DNA甲基化水平的电化学检测

四、石墨烯纳米片在功能化单分子层界面上的构筑及传感应用

本工作以功能化的胆碱修饰电极为基底，构建了具有独特空间结构和电化学性质的石墨烯传感界面。利用胆碱分子结构中羟基与阳离子自由基之间的亲核进攻反应，可以将胆碱共价键合到玻碳电极表面。利用石墨烯表面的负电荷与胆碱分子结构中–N⁺(CH₃)₃极性基团的静电作用，可以将石墨烯均匀、有序地组装到电极表面。该修饰电极具有较大的电活性面积和较快的电子传递速率，对食品中的抗氧化剂具有显著的催化作用。该方法可应用于市场上豆油、花生油和菜籽油样品中抗氧化剂的电化学检测，检测结果与经典的高效液相色谱法相吻合，研究结果发表于Sensors Actuators B Chem., 2016, 224, 885–891（TOP-SCI，一区）。

图4. 石墨烯在功能化单分子层界面上的构筑过程及其对抗氧化剂的电催化氧化

五、基于邻近杂交诱导滚环扩增的电化学均相免疫分析

基于邻近杂交诱导的滚环扩增，本工作建立了一种癌胚抗原（CEA）的均相免疫分析方法。以中性肽核酸（PNA）为捕获探针，以二茂铁为电活性指示剂，可实现电化学信号导出。基于免疫分析的基本原理，目标蛋白可诱导分子信标的构象变化，使检测方法具有较好的选择性。常见的生物分子对检测体系无显著干扰。进一步的研究表明，该方法可实现肿瘤病人和健康人血清样品中CEA的临床化验。因此，本工作的开展在癌症的早期诊断领域具有一定的现实意义，研究结果发表于Analyst, 2017, 142, 4308–4316（SCI，二区）。

图5. 基于邻近杂交诱导滚环扩增的电化学均相免疫分析原理示意图

致谢：以上研究工作得到了国家自然科学基金青年项目（21205052）、面上项目（21675067）、江苏省品牌专业和江苏省优势学科的资助。