王颇老师课题组主要开展功能化纳米传感体系的构建及其在生化分析中的应用研究，在电化学界面构建、信号放大技术的发展、核酸与细胞分析、疾病诊断、表观遗传学的研究等方面取得了阶段性进展，已主持2项国家自然科学基金和1项江苏省重点研发计划项目。近三年，以通讯或第一作者在Analytical Chemistry（2篇），ACS Sensors，Langmuir，Biosensors and Bioelectronics，Electrochemistry Communications，ACS Applied Bio Materials等国际权威期刊发表论文18篇。其中一区论文12篇，含ESI高被引论文1篇（Analytical Chemistry, 2018, 90, 1098−1103），其学科领域百分位位居前千分之一（基准阈值为0.09%，2020年5月20日数据），研究简介见“王颇课题组科研进展（一）：/aa/e5/c5482a240357/page.htm”。发表的论文先后被Nature Reviews Chemistry，Chemical Reviews，Chemical Society Reviews等国际著名综述正面评价和引用，引起了同行的广泛关注。王颇老师先后入选江苏省“六大人才高峰”高层次人才、江苏省“青蓝工程”优秀青年骨干教师；并获得徐州市“十大青年科技奖”、“淮海科学技术一等奖”、“江苏省分析测试科学技术二等奖”、“江苏省高校自然科学三等奖”、徐州市发明协会科学技术“突出贡献奖”等奖项。

1. 基于CRISPR/Cas13a信号放大的飞摩尔蛋白免疫检测

本工作利用CRISPR/Cas13a代替传统酶联免疫分析（ELISA）中酶催化底物显色作为信号输出机制，利用T7 RNA聚合酶的转录和Cas13a的反式切割活性两步放大输出信号，实现了飞摩尔水平的蛋白检测。将生物素标记的一端含有T7启动子序列的双链DNA连接到“捕获抗体-抗原-链霉亲和素标记的检测抗体”复合物上，加入T7 RNA聚合酶后，T7 RNA聚合酶能够识别T7启动子并开始转录出多个触发RNA，实现信号的第一步放大。Cas13a由crRNA引导识别并切割触发RNA，触发RNA被切割后，可激活Cas13a的反式切割活性剪切体系中的RNA荧光探针（一端标记荧光团，另一端标记淬灭团，此时荧光被淬灭）。荧光探针被剪切，使得淬灭团远离荧光团，荧光得以恢复。一个触发RNA可触发约10000个荧光探针的剪切，实现了信号的第二次放大。本工作成功检测到飞摩尔水平的人白细胞介素6（Human IL-6）和人血管内皮生长因子（Human VEGF），检出限分别为2.29 fM和0.81 fM。该体系的整个反应过程在37 °C下进行，与用于洗板和试剂分散的高通量液体处理机器人兼容，可以同时检测多种蛋白，实现高通量筛选和定量的目的，其灵敏度超过商业化试剂盒的100倍，可检测常规ELISA无法检测到的低丰度蛋白。该方法是首次基于CRISPR/Cas13a系统构建的低丰度蛋白免疫分析法，相关原理如图1所示，研究成果以2017级硕士研究生陈倩同学为第一作者发表于Analytical Chemistry, 2020, 92, 573−577。

图1. 基于CRISPR/Cas13a信号放大的免疫检测原理示意图

2. 基于超级三明治串联体信号放大的DNA甲基化双信号识别体系

本工作以二茂铁（Fc）和亚甲基蓝（MB）为信号标记，基于DNA串联体的信号放大策略，构建了一种灵敏而又准确的电化学生物传感器，实现了DNA甲基化的双信号识别。利用亚硫酸盐转化技术，非甲基化DNA分子结构中的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化DNA分子中的5-甲基胞嘧啶（5-mC）保持不变。以金纳米粒子功能化的二硫化钼修饰玻碳电极（AuNPs@MoS₂/GCE）为传感界面，根据DNA序列信息的不同，可检测DNA的甲基化状态。基于捕获DNA和信号DNA的巧妙设计，一分子的目标DNA可连接多个DNA信号探针，形成超级三明治串联体结构，显著放大了检测信号，提高了分析方法的灵敏度。将电活性的Fc和MB同时标记到信号DNA分子中，达到了双重信号识别的目的，增加了检测结果的准确度。AuNPs@MoS₂/GCE呈现出良好的界面电化学性质，为信号导出奠定了基础。在优化的实验条件下，该方法可有效识别DNA的甲基化位点，并获得了满意的分析参数，线性范围和检出限分别是10 fM−1 nM和450 aM。相关原理如图2所示，研究成果发表于ACS Sensors, 2019, 4, 2615−2622。

图2. 基于超级三明治串联体信号放大的DNA甲基化双信号识别原理示意图

3. 胞嘧啶调控的电致化学发光共振能量转移体系的构建及应用

在电致化学发光（ECL）体系中，能量供体的ECL光谱与受体吸收光谱的重叠是有效实现ECL共振能量转移（RET）的基本要求。作为一种常见的ECL发光试剂，CdS量子点（QDs）在520 nm处有较宽的ECL发射峰，因此，寻找具有520 nm吸收光谱的纳米材料是构建ECL-RET传感器的关键。本工作利用核酸包裹的Ag纳米簇的导电性、催化性能以及Ag纳米簇的吸收光谱与CdS QDs的发射光谱之间的重叠，构建了一种新型的ECL-RET传感体系，并将其应用于miRNA-21的检测。簇核酸序列中胞嘧啶的分子个数影响着Ag纳米簇的形成。通过调节胞嘧啶的分子个数，得到紫外吸收峰位于520 nm的Ag纳米簇，与CdS QDs的ECL发射光谱重叠，产生有效的ECL-RET。此外，基于双链特异性核酸酶和催化发卡组装引起的目标循环信号放大，该体系的灵敏度得到了有效的提高。据此建立了一种miRNA-21检测的新方法，其线性范围是1 fM−100 pM，该方法已成功应用于HeLa细胞提取物中miRNA-21的检测。相关原理如图3所示，研究成果发表于Langmuir, 2018, 34, 10153−10162。

图3. 胞嘧啶调控的电致化学发光共振能量转移体系的构建原理示意图

4. 基于DNA步行器的信号放大策略及其传感应用

本工作基于目标驱动的DNA步行器体系，构建了一种高灵敏的电化学传感器，并将其应用于目标DNA的电化学检测。金纳米笼具有中空、多孔的笼状结构，可有效提高纳米材料的电活性面积，增加探针DNA的负载密度。以石墨烯功能化的金纳米笼为传感界面，结合DNA 步行器和Exo III信号放大策略，可显著提高分析方法的灵敏度。本工作通过对发夹式DNA探针的巧妙设计，实现了目标DNA的序列识别和定量检测。与传统的方法相比，该方法显示出良好的选择性和较低的检出限，可应用于复杂样品中低丰度DNA含量的检测，揭示了该方法的实用价值。相关原理如图4所示，研究成果发表于Biosensors and Bioelectronics, 2018, 108, 97−102。

图4. 基于DNA步行器信号放大策略的生物传感原理示意图

5. 纸芯片传感界面的电化学构建及其在亚硝酸盐检测中的应用研究

直接氧化法是检测电活性物质的一种重要方法，然而，在传统的工作电极上，氧化产物容易堆积在电极表面，产生污染效应，影响了检测结果的准确度和重现性。本工作以真空抽滤技术为基础，基于电化学方法，构建了一种简单、便宜、易制备的纸芯片传感界面，并将其应用于亚硝酸盐的电化学检测，结果令人满意。石墨烯是一种性质良好的电极材料，采用真空抽滤技术将其组装到滤纸表面，从而得到了一种导电性薄膜。然后，将此薄膜剪切成芯片，制备工作电极，并在此工作电极上电沉积金纳米粒子，即可得到功能化的纸芯片电极。纸芯片电极的价格便宜，可作为一次性的传感器件，有效解决电极的污染问题。研究结果表明，纸芯片电极对亚硝酸钠具有良好的催化活性，可放大亚硝酸钠的电流信号，从而提高分析方法的灵敏度。此检测技术可应用于牛奶、湖水、河水和工业废水中亚硝酸盐的定量检测，分析结果与标准方法相符合。因此，本工作的开展在食品安全和环境监控等领域具有一定的理论意义和实用价值。相关表征数据和测试性能如图5所示，研究成果发表于Electrochemistry Communications, 2017, 81, 74−78。

图5. 纸芯片传感界面的形貌表征及其对亚硝酸盐的电化学检测

感谢国家自然科学基金面上项目（21675067）、青年项目（21205052）、江苏省“六大人才高峰”高层次人才培养计划（SWYY-084）、江苏省“青蓝工程”培养计划、江苏省重点研发计划（BE2019645）的资助；感谢学院提供的资源条件；感谢课题组冯秋梅老师，陈倩、王梦影、严己、秦莉、赵晓蕾、周慧等同学的辛勤工作。